Mit der revolutionären CRISPR/Cas Technologie lässt sich gezielt die DNA von lebenden Organismen präzise verändern. Dabei wird mit Hilfe einer Guide-RNA, die eine bestimmte DNA-Sequenz erkennt, ein Cas9-Protein angeheftet und die DNA zerschnitten. Dieser gezielte Schnitt ermöglicht es, die DNA an dieser spezifischen Stelle zu reparieren oder zu verändern.
Das Team von Prof. Dr. Markus Affolter am Biozentrum der Universität Basel hat nun eine neue Methode namens SEED/Harvest in der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) entwickelt. Diese kombiniert die CRISPR-Cas9-Methode mit dem Single-Strand Annealing (SSA)-Reparaturweg, was genomweite Veränderungen effizienter und ohne unerwünschte Narbenbildung ermöglicht. Die Studie wurde jetzt im Fachjournal Developmental Cell veröffentlicht.
Zwei Methoden kombiniert
Der SEED/Harvest-Methode erfolgt in zwei Schritten. In einem ersten Schritt schleusten die Forschenden ein spezielles Marker-Gen an die gewünschte Stelle in der DNA ein. Diese Markierung innerhalb einer Protein-kodierende Region dient dazu zu erkennen, ob das Einschleusen erolfgreich war. Damit können nun an dieser Zielstelle die gewünschten Änderungen durchgeführt werden.
Im zweiten Schritt wird der Marker ausgeschnitten und die DNA-Bruchstellen werden durch den Einzelstrang-Annäherungs-Reparaturweg (Single-Strand Annealing, SSA) repariert. „Dies ermöglicht uns, die DNA nahtlos zu schneiden, während ihre volle Funktion erhalten bleibt“, erklärt Erstautor Dr. Gustavo Aguilar. „Die Kombination beider Methoden ermöglicht es, jedes gewünschte Protein im Genom zu markieren, ohne Kollateralschäden zu verursachen. So können wir die Funktionen von Proteinen in lebenden Organismen untersuchen.“
Präziser und Effizienter
«Da wir für unsere Forschung Veränderungen in der DNA gerne genomweit vornehmen und untersuchen möchten, muss die Methode nicht nur präzise, sondern auch effizient sein», erläutert Affolter. „Und die SEED/Harvest-Methode ist beides. Sie kombiniert die erfolgreiche und robuste Einführung genetischen Materials mit alle Vorteilen einer nahtlose Markierung.»
Neue Forschungsmöglichkeiten
Vorteil der SEED/Harvest Methode ist es, dass wie Proteine in spezifischen Geweben und Zelltypen markieren können. «Wir können in verschiedenen Geweben und Entwicklungsstadien selbst bestimmen, wann und wo die Gene aktiviert oder deaktiviert werden», fügt Gustavo Aguilar hinzu. Dies eröffnet der Forschung neue Möglichkeiten, um die Dynamik von Proteinen systematisch in lebenden Zellen in Echtzeit zu untersuchen.
Nicht nur für die Genetik und Biotechnologie ist diese Methode von grosser Bedeutung. «Auch für die medizinische Forschung könnte die SEED/Harvest-Methode von Interesse sein, um beispielsweise um fehlerhafte Gene, die zu Krankheiten verursachen, zu identifizieren», so Affolter.
Universität Basel
Originalpublikation:
Gustavo Aguilar, Milena Bauer, M. Alessandra Vigano, Sophie T. Schnider, Lukas Brugger, Carlos Jiménez-Jiménez, Isabel Guerrero, and Markus Affolter: Seamless knockins in Drosophila via CRISPR-triggered single-strand annealing. Developmental Cell. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2024.06.004
