Protoplastenfusion

Durch enzymatischen Abbau der Zellwände gewonnene Protoplasten können durch Polyethylenglykol (PEG) fusioniert werden . Dies funktioniert auch über Artgrenzen hinweg.

fusionierende Protoplasten, Quelle

Detaillierte Versuchsbeschreibung:
      Protoplastengewinnung: NCBE
      Protoplastenfusion: s.u.
alternativ: nli-Berichte 61, Biotechnik im Sekundarbereich I, Band 4: Herbizidresistente Pflanzen, S. 27-37

Versuchsprinzip:

Protoplastengewinnung:
Protoplasten können aus praktisch jedem beliebigen Pflanzenmaterial gewonnen werden, allerdings bietet sich die Wahl unterschiedlich gefärbter Zellen an, z.B. aus Blüten, roten Zwiebeln oder einfach Salat. Im Saft frischer Tomaten kommen bereits freie Protoplasten vor! Zellwände und Mittellamellen werden mit einem Enzymgemisch (Cellulase und Pectinase, z.B. Viscozyme) abgebaut. Dies geschieht entweder im 37°C-Wasserbad in 25 min, bei 20°C in einer Stunde oder im Kühlschrank in 24 Stunden.
Es gibt grundsätzlich zwei Wege, die Protoplasten aus dem Zellverband in eine Suspension zu bekommen: Entweder durch rühren, filtrieren, zentrifugieren und resuspendieren (vgl. NCBE-Anleitung) oder durch "ausschütteln" (vgl. nli-Bericht). Dazu nimmt man das enzymatisch bearbeitete Pflanzenstück mit der Pinzette und bewegt es in einem Tropfen der Ziellösung auf einem Objektträger vorsichtig hin und her.

Protoplastenfusion:
In einer konzentrierten PEG-Lösung fusionieren Protoplasten spontan.

Versuchsbeschreibung Protoplastenfusion:

Geräte: Mikroskope (100-fache Vergrößerung), Objektträger (keine Deckgläser!), Tropfpipetten
Verbrauchsmaterial: unterscheidbare Protoplasten (s.o.)
PEG-Lösung (9 g "Polyethylenglycol 6000" in 20 ml Leitungswasser, löst sich nur langsam)
Zeitbedarf: 30 min
Ablauf:
1. Gib mit einer Tropfpipette je einen Tropfen zwei verschiedener Protoplastensuspensionen dicht nebeneinander auf einen Objektträger.
2. Gib mit einer anderen Tropfpipette einen Tropfen der PEG-Lösung so zwischen die vorhandenen Tropfen, dass diese zusammenfließen können.
3. Beobachte - ohne Deckglas! - einige Minuten im Mikroskop. Dokumentiere Deine Beobachtungen in Zeichnungen!


Geräte (Auswahl):

Mikroskope (100-fache Vergrößerung)
ggf. 37°C-Wasserbad
ggf. Filter und Zentrifuge

Verbrauchsmaterial: (Auswahl)

verschiedenfarbiges Blattmaterial (ca. 5x5 cm pro Gruppe), ev. Tomaten
Sorbit, Zucker
Cellulase und Pectinase (z.B. Viscozyme: NCBE)
Polyethylenglykol

Zeitbedarf im Unterricht:

Protoplastengewinnung: 15 - 25 min Praxis + 5 min Theorie
Protoplastenfusion: 30 min Praxis + 5 min Theorie

gesamte Versuchsdauer:

45 min - 2 Tage, optionaler Stopppunkt nach Gewinnung der Protoplasten

Vorlauf:

ggf. Bestellzeit für Chemikalien

Kosten: Investitionen

Geräte i.d.R. vorhanden (s.o.)

Kosten: Verbrauchsmaterial

1 - 5 €

Empfehlung: Mittelstufe

sinnvoll

Empfehlung: Unterstufe

u. U. möglich, wenn Mikroskopiererfahrung vorhanden

handwerklicher Anspruch:

mittel, Übung im Mikroskopieren

Praxisnähe:

hoch

Anknüpfungspunkte:

monoklonale Antikörper

Quellen:

Enzymmix: NCBE
PEG: fast alle Chemikalienvertriebe

Tipps:

Die Protoplastengewinnung kann vom Lehrer in 30 min vorbereitet werden, wenn im Unterricht die Zeit zu knapp ist.

 

 
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